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细胞实验介绍——慢-建立稳转细胞系

慢-包装：公司使用3质粒慢-包装系统，慢-系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，过表达慢-系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢-颗粒纯化试剂盒将慢-纯化。纯化后留取部分检测-滴度，其余-冻存于-80℃冰箱中。处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外--组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出，后用第三组剪刀和镊子将小心取出放在盛有d-pbs的玻璃平皿中，冲洗去血。

滴度检测：将-颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算-滴度。

细胞：在-前-对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释-，加入12孔板中对细胞进行，-数量根据细胞的moi加入若无moi，需做-梯度：1,5,10,50,100 5个梯度对细胞，6h后去除含-溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的基因的稳定表达情况。2作为标志分子,percoll离心后细胞悬液经facs分选后获得细胞纯度。

实验流程：慢-质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞--收集--纯化--滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 a -滴度检测；b 目的细胞-效果图

自噬(autophagy)是细胞受到-后吞噬自身的细胞质或细胞器，终将吞食物在溶酶体内降解的过程,自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构,内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白-物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、

-和-等。单丹-尸胺(dansylcadaverine,mdc是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被于检测自噬体形成的特-标记染色剂,其检测激发滤光片波长355nm ,阻断滤光片波长512nm。leagene mdc染色液适用于培养细胞的自噬染色，可与eb合用双染。自噬流检测自噬是调节真核细鹏生长、和能量代谢的重要生物学机制。

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-是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。-的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达，通过不同基因表达的开启或关闭，终产生-蛋白质。细胞-是指将一群不同类型或者形态结构、功能特征存在差异的细胞通过生物学、物理学等手段，将之转变为具有相似/相同形态结构、功能特征的细胞群体的过程。其检测原理为huo细胞内线粒体中的-脱氢酶能催化外源性无色的mtt形成蓝色的结晶formazan，并沉积在细胞中，而-无此功能。

1、操作步骤 [方法一]：

(1) 细胞培养：取 6 孔培养板 (或用 35 mm 培养皿)，向每孔中加入 2 ml 含 1～2×105 个细胞培养液，37℃ co2 培养至 40%～60% 汇合时 (汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2) 转染液制备：在聚-乙稀管中制备以下两液 (为转染每一个孔细胞所用的量)a 液：用不含培养基稀释 1-10 μg dna，终量 100μl，b 液：用不含培养基稀释 2-50 μglr，终量 100μl，轻轻混合 a、b 液，室温中置 10-15 分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染 (如出现沉淀可能因 lr 或 dna 浓度过高所致，应酌情减量)。细胞培养：然后在无菌恒温细胞培养箱内培养接种好的96孔细胞培养板，并实时观察细胞状态。

(3) 转染准备：用 2 ml 不含培养液漂洗两次，再加入 1 ml 不含培养液。

(4) 转染：把 a/b 复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃ 温箱置 6～24 小时，吸除无转染液，换入正常培养液继续培养。

(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

注意：转染时切勿加，对转染效率有很大影响。