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蛋白提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于-、-等有ji溶剂中，因些，可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度-于溶 解，缩短提取时间。但另一方面. ,温度升高会使蛋白质变性失活,因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi--,碘yi酸等)。目前研究mirna的方法主要是realtime-pcr、生物芯片技术以及第二代测序技术。

蛋白质双向电泳实验流程

1.-yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.双向电泳分离待测样品

(1)一相等电-前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml,否则会造成蛋白质的-或沉淀。

(2)等电-完毕后(约需24hr，若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。

(3)等电-好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%sds-page凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5w/胶 45min，15w/胶 5-8hr，20℃。

3.银染法对凝胶进行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗

3.凝胶扫描及图像分析

(1)图像扫描：凝胶染色后采用image scanner以300dpi，16-bit模式65536灰阶进行扫描。

(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用imagemaster 2d platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以zui小点面积30，平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1。

蛋白质定量组学服务

细胞内蛋白质组丰度的动态变化对不同生命过程有重要影响。例如在许多-的发生和发展进程中，常常伴随着某些蛋白质的表达异常。目前定量蛋白质组学技术主要分为标记(label)策略和非标记的(label free)定量策略，其中标记策略又分为体内标记(如 silac、15n 标记)，以及体外标记(如 itraq、tmt 标记) 。microrna通过和靶基因mrna碱基配对引导沉默复合体risc降解mrna或抑制mrna的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达新发现mirna也能在转录水平调控基因表达。

传统的基于2d双向凝胶电泳分离的蛋白质组通常可以鉴定出约1000种蛋白，对全蛋白质组的覆盖仅在5~10%左右，不能满足高通量定量蛋白质表达谱分析的要求。我们结合样品制备与高分辨率、高灵敏度的液相色谱-质谱联用技术，可在细胞与组织类样品中鉴定直至多于10000个蛋白，对全蛋白质组的覆盖>;60%。结合生物信息学分析，为您构建高通量蛋白质定量表达谱。高l效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的-的分析测定，-是多组分-的测定、杂质检查和大分子物质的测定。

高l效液相色谱法检验方法

高l效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离-，分析速度快的特点。腺相关-的滴度在1012~1013gc/ml,可以满足各类整体实验的使用要求。

高l效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的-的分析测定，-是多组分-的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的-需要在色谱分离前或后经过衍生化反.应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有硅胶用于正相色谱;化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中常用的是十八烷基硅l烷(又称ods)键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。这一新产品将可捕获64m的基因组序列，包括外显子以及mirna，它含与其他nimblegen液相捕获产品相同的2。