实时荧光定量PCR-上海PCR-南京英瀚斯

外显子测序

外显子组测序exome-seq是对定向富集的基因组dna进行高通量测序，它能够以相对低的费用对人类外显子组进行拷问。2009年，实时荧光定量pcr，外显子组捕获工具的出现，让外显子组测序这种技术迅速红起来。到目前为止，已有超过1万个外显子组被测序。

如今有多家公司推出了外显子组捕获试剂，包括罗氏nimblegen、安捷伦、illumina，还有现在的华大基因。这些方法究竟孰优孰劣，斯坦福大学医学院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。该研究结果发表在《nature biotechnology》上。研究人员利用安捷伦、illumina和nimblegen的外显子组测序平台对同一个人类---样品进行分析。他们的结 果表明，nimblegen平台作为一个使用高密度重叠探针的平台，尽管覆盖了较少的基因组区域，但在灵敏检测小的变异时所需的测序量也少。在同样获得80m测序数据的情况下，nimblegen有97%的目标序列达到10x以上的测序---，---多少钱，而其他产品只有90%。而安捷伦和illumina的探针能够在低密度下捕获更多数量的变异。此外，illumina还捕获了未翻译的区域，这是nimblegen和安捷伦平台无法靶定的。研究人员还比较了同一样品的外显子组测序和全基因组测序wgs，显示外显子组测序能够检测到wgs错过的小变异。

除了文中提到了三个主流平台，外显子组捕获方面的新产品也在不断推出，研究人员的选择也将更广泛。罗氏nimblegen即将推出新一代的外显子液相捕获产品。这一新产品将可捕获64m的基因组序列，包括外显子以及mirna，它含与其他nimblegen液相捕获产品相同的2.1m高密度探针，以高xiao、均一、特异、的定向捕获。

聚合酶链式反应(pcr)

操作步骤

1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1qpcr buffer

5 μl

dntp mix( 2mm )

4 μl

引物1(10pm)

μl 2

引物2 ( 10pm)

2μl

taq酶(2u/ul)

1 μl

dna模板( 50ng-1μg/μl )

1 μl

加ddh2o至

μl 50

视pcr仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上执行扩增。-般:在93°c

预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ，循环30-35

次，后在72°c保温7min。

3.结束反应， pcr产物放置于4°c待电泳检测或-20°c长期保存。

4. pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ul进行抽提反应混合液，以

除去石蜡油;否则，直接取5- 10μl电泳检测。